teoria cwiczenie 3b, technologia żywności, mikrobiologia
[ Pobierz całość w formacie PDF ]
Metody oznaczania liczby drobnoustrojów (ćwiczenie 3)
Liczbę mikroorganizmów występujących w danym środowisku można określić
różnymi metodami. Powszechnie stosowane metody dzielą się na bezpośrednie i
pośrednie. Metody bezpośrednie służą do oznaczania sumy żywych i martwych
komórek. Metody pośrednie (hodowlane) opierają się na obserwacji wzrostu żywych
komórek.
Bezpośrednie metody oznaczania liczby drobnoustrojów:
Oznaczanie liczby komórek w polu widzenia mikroskopu
. Sposób postępowania:
o
na środku szkiełka podstawowego wyznacza się flamastrem kwadrat o boku
10 mm;
o
na wyznaczoną powierzchnię przenosi się mikropipetą 0,01cm
3
badanej
zawiesiny bakterii i równomiernie rozprowadzacza po powierzchni;
o
preparat suszy się i utrwala, zabarwia błękitem metylenowym (1-2 min), a
następnie spłukuje wodą i suszy;
o
liczbę komórek liczy się w 20 polach widzenia mikroskopu (powiększenie
1000x), po wyliczeniu średniej uzyskane dane podstawia się do wzoru:
Obliczanie wg wzoru:
A = N x 4 x 10
4
/ πd
2
; gdzie:
A – liczba komórek;
N – średnia liczba bakterii w jednym polu widzenia
d – średnica pola widzenia [mm]
Objaśnienie obliczeń:
Średnica pola widzenia mikroskopu d = 0,16 mm
Powierzchnia pola widzenia πr
2
= 3,14 (0,08)
2
= 0,02 mm
2
Powierzchnia rozmazu 10 x 10 = 100 mm
2
Jedno pole widzenia reprezentuje 1/5000 część powierzchni rozmazu,
która wynosi 0,01 cm
3
.
Jedna komórka w polu widzenia odpowiada 5.000 komórek w objętości
0,01 cm
3
lub 500.000 komórek w objętości 1 cm
3
.
Komory
- służą do bezpośredniego liczenia drobnoustrojów pod mikroskopem.
Komora
Thoma
(hemocytometr) – szklana płytka z 2 wgłębieniami (głębokość
0,1 mm) i naniesioną siatką podzieloną na 16 dużych kwadratów .Każdy z tych
kwadratów składa się z 16 małych kwadracików o boku 0,05 mm i objętości
pod szkiełkiem nakrywkowym 1/4000 mm
3
.
Rys.1. Komora Thoma
Komora
Bürkera
- szklana płytka z 2 wgłębieniami (0,1 mm) i siatką
podzieloną na kwadraciki o boku 0,2 mm, powierzchni 0,04 mm
2
i objętości
pod szkiełkiem nakrywkowym 0,004 mm
3
;
Komora
Howarda
–
szklana, gruba płytka z wyżłobionym dołkiem o
głębokości
0,1
mm,
który
przykrywa
się
szkiełkiem
nakrywkowym,
posiadającym 25 przeźroczystych pól o średnicy 1,382 mm. Stosowana w
analizach obecności grzybów pleśniowych w sokach.
Oznaczanie liczby komórek przy użyciu komory Thoma.
Komora Thoma jest wykorzystywana do liczenia komórek o wymiarach większych
niż 0,4 mm, czyli drożdży, zarodników i fragmentów strzępek grzybów. Komora
ma naniesioną siatkę 16 dużych kwadratów, z których każdy zawiera 16 małych
kwadracików o boku 0,05 mm (o powierzchni 1/400 mm
2
i objętości 1/4000 mm
3
).
Badany materiał nanosi się na komorę, przykrywa szkiełkiem nakrywkowym i liczy
pod mikroskopem przy powiększeniu 400x. Dla wiarygodnego wyniku należy
policzyć komórki zgodnie z załączonym schematem w 40-80 małych kwadratach.
Aby błąd obliczeń nie przekroczył 10% należy zliczyć co najmniej 700 komórek.
Obliczanie przeprowadza się według wzoru:
N = 4 x 10
6
x a
śr
x r
a
śr
– średnia liczba komórek w małym kwadracie
r – rozcieńczenie badanej próbki.
Rys. 2. Sposób liczenia komórek w komorze
[ Pobierz całość w formacie PDF ]