teksty.dietetyka, dietetyka, MGR, 4 rok, materialy immunologia
[ Pobierz całość w formacie PDF ]
//-->Ćwiczenie 1. Metody oceny antygenów i przeciwciał oparte na reakcji precypitacjiPodstawy reakcji precypitacjiReakcja precypitacji jest najprostszym typem reakcji wiązania się antygenu ze swoistymprzeciwciałem. Zachodzi zarówno w środowisku płynnym jak i stałym. Antygeny biorące udziałw reakcji to rozpuszczalne w wodzie antygeny białkowe (zarówno pełnowartościowe, jaki resztkowe, czyli hapteny, które nabywają zdolność indukowania odpowiedzi immunologicznejpo połączeniu z białkiem nośnikowym) o masie cząsteczkowej od 40 do 160 kD. Kolejną ważnącechą antygenu jest jego wielowartościowość, czyli posiadanie co najmniej dwóch determinantantygenowych. Przeciwciała precypitujące to przeciwciała wykazujące wysokie powinowactwo,czyli wysoką siłę wiązania się z determinantami antygenowymi.Reakcja precypitacji zachodzi dwuetapowo. W pierwszym etapie antygen reaguje zeswoistym przeciwciałem i powstaje kompleks antygen-przeciwciało, który w drugim etapie,w strefie równowagi ich stężeń, zostaje wytrącony w roztworze pod wpływem elektrolitóww postaci precypitatu widocznego jako zmętnienie środowiska. Na przebieg reakcji wpływająróżne czynniki:- stosunki ilościowe antygenu i przeciwciała; antygen i przeciwciało łączą się ze sobą wróżnych stosunkach ilościowych, ponieważ mają różną wartościowość. Reakcja ta zachodzinajszybciej w strefie ekwiwalencji, czyli równowagi obu reagentów. Przy nadmiarze przeciwciałlub antygenu kompleksy są rozpuszczalne;- stężenie elektrolitów; optymalne stężenie uzyskuje się stosując 0,85% roztwór NaCl.Wyższe stężenie jonów w środowisku reakcji powoduje zmniejszenie ilości utworzonegoprecypitatu;- temperatura; zależnie od gatunku, od którego pochodzi surowica odpornościowa(surowica zawierająca swoiste przeciwciała otrzymana w wyniku uodpornienia określonymantygenem) przeciwciała będą precypitowały w różnych temperaturach. Np. przeciwciałakrólicze jednakowo precypitują w temperaturze 37˚C, 20˚C i 4˚C, natomiast przeciwciałakońskie precypitują szybciej w temperaturze 37˚C;- pH środowiska; optymalna wartość pH dla tej reakcji mieści się w granicach 6,5 - 8,5;- dopełniacz; kompleksy antygen-przeciwciało aktywują układ dopełniacza, który możeczęściowo rozpuszczać kompleks. Dlatego do reakcji należy stosować surowice zinaktywowane(na przykład za pomocą chlorku choliny).Immunodyfuzja jest reakcją precypitacji zachodzącą w środowisku stałym. Oparta jest nazjawisku dyfuzji cząsteczek antygenu i przeciwciała w żelu. W środowisku żelowym precypitatpowstaje w miejscu zetknięcia się dwóch reagentów będących w optymalnych stosunkachilościowych, czyli w strefie ekwiwalencji, i powstaje w postaci linii, łuku lub pierścieniaprecypitacyjnego. Szybkość dyfuzji w żelu jest wprost proporcjonalna do stężenia reagentów,a odwrotnie proporcjonalna do wielkości cząsteczek. Jako środowisko reakcji stosuje się żelagarowy, agarozowy lub poliakrylamidowy, pozwalające na swobodną dyfuzję reagentów.Reakcja immunodyfuzji zależy od tych samych czynników, co reakcja precypitacji. Przydłuższym przetrzymywaniu prób z precypitatami żel użyty do odczynu należy zabezpieczyćprzez dodanie do niego azydku sodu.Przykłady praktycznego zastosowanie reakcji precypitacji w diagnostyce medycznej1. Odczyn precypitacji pierścieniowej. Odczyn ten jest testem jakościowym, służącym dowykrywania antygenu lub przeciwciał w płynach ustrojowych. Ma praktyczne zastosowanie w:wykrywaniu w badanym materiale obecności antygenów bakteryjnychklasyfikacji bakteriiwykrywaniu obecności obcych białek w fałszowanych produktach spożywczychokreślaniu pochodzenia plam z krwi i innych płynów ustrojowych (w medycynie sądowej)2. Test VDRL. Inaczej odczyn flokulacyjny - test kłaczkujący. Szybki test jakościowy. Mapraktyczne zastosowanie w:diagnostyce kiły wykrywanie w surowicy pacjenta obecności przeciwciał przeciwkoTreponema pallidum,bakterii wywołującej kiłę3. Odczyn pierścieniowej immunodyfuzji radialnej (odczyn Manciniego). Test wykonywanyw środowisku stałym (immunodyfuzja) służący do ilościowej oceny białek w płynachustrojowych. Ma praktyczne zastosowanie w:oznaczaniu stężenie różnorodnych białek ustrojowych, w tym: albuminy, składowychdopełniacza, apolipoprotein, CRP, ceruloplazminy, transferyny, fibronektyny, lizozymu,IgG, IgM, IgA, IgD oraz podklas immunoglobulin (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2),a także łańcuchów lekkich immunoglobulinĆwiczenie 2. Metody oceny antygenów i przeciwciał oparte na reakcji aglutynacjiPodstawy reakcji aglutynacjiAglutynacja to reakcja między swoistymi przeciwciałami a antygenemupostaciowanym(w przeciwieństwie do antygenów rozpuszczalnych w wodzie biorących udział w reakcjiprecypitacji). Reakcję aglutynacji można podzielić na dwa typy:a)aglutynację bezpośrednią (czynną)czyli taką reakcję, w której antygeny są„naturalnymi” składnikami błony lub ściany komórek np. erytrocytów, leukocytów, komórekbakterii, grzybów, pierwotniaków.b)aglutynację pośrednią (bierną)czyli taką reakcję, w której antygen zostaje jedynieopłaszczony na nośniku np. cząsteczce lateksu, bentonitu, polistyrenu, erytrocycie. Gdynośnikiem danego antygenu są erytrocyty, reakcję aglutynacji nazywamyhemaglutynacjąbierną.Wodczynie lateksowymnośnikiem antygenu są cząsteczki lateksu.Reakcja aglutynacji, podobnie jak precypitacji, przebiega dwuetapowo. W pierwszymetapie następuje związanie antygenu przez swoiste przeciwciała, w drugim natomiast powstałekompleksy immunologiczne (antygen + przeciwciało) w obecności elektrolitów wypadająz roztworu w postaci obserwowanych makroskopowoaglutynatów.Jako środowisko reakcjinajczęściej stosujemy 0,85% roztwór NaCl o pH 6,8 - 7,2, lecz do niektórych testów wymaganejest pH w granicach 4,1 - 4,4 (np. aglutynacja pałeczekSalmonella).W prawidłowym przebiegureakcji aglutynacji, istotna jest także temperatura reakcji. W zależności od użytych reagentównależy ją odpowiednio dobrać (4°C, 20°C lub 37°C). UWAGA! Surowica odpornościowa użytado reakcji aglutynacji musi zostać wcześniej zinaktywowana czyli pozbawionadopełniacza,gdyż kompleksy immunologiczne mają zdolność wiązania dopełniacza.Odczyny aglutynacji przeprowadzamy na mikropłytkach, na szkiełkach przedmiotowych(aglutynacja szkiełkowa) lub w probówkach (aglutynacja probówkowa).Przykład aglutynacji bezpośredniejBakteria ma na swojej powierzchni antygen „X”Przeciwciała IgM skierowane są przeciwko antygenowi „X”Wynik reakcji: Komórki bakteryjne opłaszczone przeciwciałami łączą się w duże agregatyi wypadają z zawiesiny w obecności elektrolitów w postaci widocznego makroskopowoaglutynatu.Przykłady praktycznego zastosowania reakcji aglutynacji w diagnostyce medycznej:1. Odczyn aglutynacji szkiełkowej. Szybki test jakościowy stosowany do:identyfikacji szczepów bakteryjnych, szczególnie pałeczek jelitowych z rodzinyEnterobacteriaceae,w tymSalmonellaiShigella flexneriokreślania grup krwi (patrz: ćwiczenie 3)2. Odczyn aglutynacji probówkowej. Odczyn ten służy do ilościowej oceny poziomu swoistychprzeciwciał (wyrażany jako miano surowicy) w płynach ustrojowych. Stosowany jest praktyczniew:diagnostyce duru brzusznego i duru rzekomego – odczyn Widala - wykrywanieobecności swoistych przeciwciał przeciwkoSalmonella typhi(pałeczka duru brzusznego)lubSalmonella paratyphi(pałeczka duru rzekomego)diagnostyce zakażeń bakteriami z rodzinyRickettsiaceae(dur plamisty) – odczyn Weil-Felixadiagnostyce zakażeń bakteriami z rodzajuBrucella(bruceloza) – odczyn Widala-Wrighta3. Odczyn hemaglutynacji biernej. Test przydatny do ilościowej oceny poziomu swoistychprzeciwciał (wyrażany jako miano surowicy) w płynach ustrojowych. Praktycznie stosowany w:diagnostyce chorób reumatycznych i zespołu Sjogrena (choroba autoimmunizacyjna) –odczyn Waalera-Rosego (wykrywanie czynnika reumatoidalnego)4. Test lateksowy. Bardzo szybki, jakościowy i półilościowy test niezwykle przydatnyw diagnostyce klinicznej. Praktycznie stosuje się go do:oceny poziomu antystreptolizyny O, CRP, czynnika reumatoidalnegooceny poziomu swoistych przeciwciał w diagnostyce mononukleozy zakaźnej, kiły,tocznia rumieniowatego układowego i zakażeń wywołanych przezHelicobacter pyloriidentyfikacji rotawirusów i adenowirusów w kalediagnostyce zakażeń wywołanych przez paciorkowce (klasyfikacja bakterii)Ćwiczenie 3. Zastosowanie metody aglutynacji w wybranych testach serologicznychSerologiato dział immunologii i immunodiagnostyki zajmujący się badaniem i ocenąantygenówiprzeciwciałwekrwi.Serologiamaszczególnieistotneznaczeniew immunohematologii, która obejmuje badanie odpowiedzi immunologicznej na antygenyznajdujące się na elementach morfotycznych krwi. Znajomość zróżnicowania antygenowegoskładników krwi jest kluczowa w transfuzjologii, ma również istotne znaczenie w ginekologiii położnictwie, transplantologii i medycynie sądowej.Układy grupowe krwi.Dotychczas zidentyfikowano 29 układów grupowych krwi,a najważniejszym z nich jestukład grupowy ABO.Antygeny należące do tego układu sąpolisacharydami występującymi na krwinkach w trzech podstawowych typach; charakteryzująsię one silną antygenowością. Występują nie tylko w błonie erytrocytów, ale i na innychkomórkach (oprócz komórek nerwowych) oraz w płynach ustrojowych (oprócz płynu mózgowo-rdzeniowego). Układ ABO jest jedynym układem w obrębie którego znajdują się we krwinaturalne przeciwciała (głównie IgM) przeciwko antygenom nieobecnym na własnychkrwinkach. Podział na grupy krwi opiera się na obecności w błonie komórkowej erytrocytówodpowiedniego antygenu, a w surowicy odpowiedniego naturalnego przeciwciała.Antygen w błonieerytrocytówPrzeciwciało naturalnew surowicyGrupa krwiGrupa Apodgrupa A1podgrupa A2A1 – silna odmiana antygenu AA2 – słaba odmiana antygenu Aanty-BGrupa Bantygen Banty-AGrupa ABpodgrupa A1Bpodgrupa A2BGrupa 0antygen A1 i antygen Bantygen A2 i antygen Bbrakantygen Hanty-A i anty-BUkład grupowy Rh.Antygeny układu Rh występują tylko w błonie erytrocytów. W tymukładzie występuje 5 głównych antygenów – D, C, E, c oraz e. Najsilniejszą immunogennośćwykazuje antygen D i dlatego podział na grupy opiera się na obecności (grupa Rh+) lub braku
[ Pobierz całość w formacie PDF ]